Hybridomatechnik: eine neue biologische Dimension in der Reproduktionsforschung

Zusammenfassung

In dieser Arbeit werden die theoretischen Grundlagen der Hybridomatechnik zur Erzeugung monoklonaler Antikörper dargestellt und die praktische Implikation dieses Verfahrens am Beispiel der Spermatozoen-Antigene im Zusammenhang mit Problemen der Sterilität und Kontrazeption aufgezeigt.

Durch Immunisierung mit intakten gewaschenen menschlichen Spermatozoen konnten nach drei Zellfusionen insgesamt 239 Hybridkolonien hochgezüchtet werden. Die antikörperenthaltenden Kulturüberstände wurden mit dem Enzyme-Linked-Immuno-Sorbent-Assay (ELISA) gegen Spermatozoen und Seminalplasma ausgetestet. Ferner untersuchten wir die Reaktion eluierter Spermatozoen-Peptidgemische und die eines synthetisierten Deka-Peptids mit den monoklonalen Antikörpern. Außerdem wurde die Reaktion mit entsprechenden Antigenen immunohistochemisch mit der Peroxidaseund Fluoreszenzmethode an fixierten Spermien und zur Kreuzreaktionsüberprüfung an Kryostatschnitten lokalisiert. An weiteren Testverfahren für die biologische Wirksamkeit der Antikörper wandten wir die Spermagglutination und Spermimmobilisation an. 149 der erhaltenen Hybridkolonien produzierten mit menschlichen Ejakulatbestandteilen reagierende Antikörper. 136 davon reagierten sowohl mit Spermatozoen als auch mit Seminalplasma, in 7 Fällen konnte eine ausschließliche Reaktion mit Spermatozoen und in 6 Fällen eine selektive Affinität zum Seminalplasma festgestellt werden. Fünf Antikörper zeigten spermagglutinierende und 15 spermimmobilisierende Aktivität.

Nur bei den Sekretionsprodukten von 32 der erzeugten Zellinien ergab sich keine Kreuzreaktion mit menschlichem Milzzellhomogenat oder an Kryostatschnitten menschlicher Tonsillen. Fünf dieser Zellinien - A-24, B-20, VI-1, VI-16 und VII-5 - wurden eingehender untersucht. Bei diesen Antikörpern handelte es sich um Immunglobuline der Klassen IgG₁ (x) (A-24, B-20, VI-16 und VII-5) und IgG₃ (x) (VI-1). Eine Spermatozoenspezifität konnte bisher lediglich für den Antikörper der Zellinie VII-5 vermutet werden, da die übrigen vier Kreuzreaktionen mit anderen untersuchten menschlichen Geweben zeigten.

Jedoch könnte die eingehende Erforschung der noch verbliebenen Zellinien weitere spezifische und biologisch wirksame Antikörper identifizieren. Der bereits charakterisierte Antikörper VII-5 reagierte ebenfalls deutlich mit dem von unserer Arbeitsgruppe beschriebenen Spermatozoenpeptid sowie seinem synthetischen Korrelat.

Abstract

This report introduces the theoretical background of the hybridoma technique for the production of monoclonal antibodies and shows the applicability of this method for spermatozoal antigens within the frame of sterility and contraception.

239 hybridoma cell lines were obtained from three cell fusions after immunization of spieen donor mice with intact washed human spermatozoa. Antibody containing culture supernatants of these hybridomas were tested in an enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) for reactivity with spermatozoal peptide mixtures obtained by autolytic processes and that of a synthetic decapeptide. Localization of the corresponding antigens was performed on fixed spermatozoa by both peroxidase and fluorescence methods, as well as on cryostat sections of human tissues for cross-reactivity testing. Sperm agglutination and sperm immobilization were used as the criteria for determining the biological activity of the antibodies. 149 of the obtained hybridomas produced antibodies reactive with components of human ejaculates. 136 of these reacted with spermatozoa, as well as with seminal plasma whereas in 7 cases an exclusive reaction with spermatozoa and in 6 cases a selective affinity to seminal plasma was detected. Five antibodies expressed sperm agglutinating and 15 sperm immobilizing activities.

Only 32 of all the cell lines produced antibodies noncross-reactive with homogenate of human spleen tissue or with cryostat sections of human tonsils. Five of these antibodies - A-24, B-20, VI-1, VI-16 and VII-5 - were studied in detail.

The antibodies belonged to the Immunoglobulin subclasses IgG₁ (K) (A-24, B-20, VI-16, VII-5) and IgG₃ (x) (VI-1). Specificity for spermatozoa was indicated for the antibody from clone VII-5, while the other four showed cross-reactivity with various human tissues tested. Further investigation of the remaining cell lines may identify other specific and biologically active antibodies. The characterized antibody VII-5 is also reactive with the spermatozoal peptide described by our group and with its synthetic analog.